Spherisorb色谱柱的安装、平衡和初始柱效测试
Spherisorb分析柱耐用、柱效高，出现在数千篇色谱参考文献中。色谱柱长度和直径范围广，在优化方法和减少溶剂消耗方面为您提供了极大的灵活性。按照本手册中的指导，从您的分析色谱柱和保护柱中获得最佳性能、再现性和耐用性。
每根Spherisorb色谱柱都附带一份性能测试色谱图。此性能测试色谱图会提供每根色谱柱的以下信息：凝胶批号、色谱柱序列号、USP理论塔板数、USP拖尾因子、容量因子以及色谱条件。请妥善保存性能测试色谱图，以备将来参考。
A.色谱柱安装
注：下述步骤给出的流速适用于典型的4.6 mm内径色谱柱。可根据所安装Spherisorb色谱柱的柱内径、柱长、粒径和柱压相应地提高或降低流速。色谱柱内径和/或柱长改变时，请参阅“放大/缩小等度分离方法"部分计算流速。有关连接HPLC的详细信息，请参阅“将色谱柱连接到HPLC系统"。
1、反相色谱柱
1）灌注泵系统，排出含缓冲液的流动相，然后将色谱柱的入口端连接至进样器出口。
2）用100%有机流动相(甲醇或乙腈)冲洗色谱柱，泵流速设置为0.1 mL/min，并在5 min内增加至1 mL/min。
3）当流动相可从色谱柱出口自由流出时，停止液流并将色谱柱出口连接至检测器。这能防止空气进入检测系统，使系统更快达到基线平衡。
4）按照步骤2所述逐渐增加流速。
5）一旦柱压和基线达到稳定状态，即可继续进行下一部分操作。
2、正相色谱柱
注：以下操作假定您的系统运行过反相色谱分析。如果并非如此，您可以从第3步开始。
1）灌注泵系统，排出任何含有缓冲液的流动相。
2）用乙腈彻底冲洗系统。
3）将系统的流动相换成您计划在正相色谱中使用的流动相。
4）连接色谱柱并用流动相平衡色谱柱。
注：用流动相平衡色谱柱时消耗的溶剂量可能比反相色谱更多。
B.色谱柱平衡
Spherisorb色谱柱是在测试用流动相中保存的。在更换为其他流动相体系之前，务必确保流动相的兼容性。请用至少10倍柱体积的流动相平衡色谱柱(请参阅表2中的空色谱柱体积)。
1、反相色谱柱
为了避免流动相缓冲液在色谱柱或系统中发生沉淀，请使用5倍柱体积的水/有机溶剂混合物冲洗色谱柱，其中有机溶剂比例应与所需缓冲盐流动相中的有机溶剂比例相同或更低。(例如，使用60%甲醇水溶液冲洗色谱柱和HPLC系统，然后再引入60%甲醇/40%缓冲液组成的流动相)。
注：如果流动相中的添加剂浓度较低(例如离子对试剂)，那么完成平衡可能需要100-200倍柱体积的流动相。
2、正相色谱柱
(Spherisorb硅胶色谱柱、氨基柱、氰基柱)
Spherisorb正相(NP)色谱柱出厂时用96%庚烷/4%异丙醇保存。请谨慎操作，避免让任何可能导致沉淀的流动相通过色谱柱(见上文)。Spherisorb正相(NP)色谱柱与水和所有常用的有机溶剂兼容，前提是考虑溶剂的混溶性。
用流动相平衡正相硅胶色谱柱。即使流动相中只含非常少量的水，也会显着影响正相填料的活性。为获得良好的重现性，请确保流动相的水含量始终相同。
流动相中的水很难彻底去除，且通常也没必要这样做。使用无水流动相可能要花很长时间才能使色谱柱达到平衡。对于大多数应用，推荐采用的含水量为饱和值的50%。
要平衡色谱柱：
1）从0.0 mL/min开始，以0.1 mL/min的增量使流速增加到1.0mL/min。
2）用流动相平衡色谱柱，直至基线稳定。
3）比较2-3次连续的重复进样，验证标准品的保留时间和峰面积是否稳定。
使用新色谱柱运行首次分析之前，请先执行柱效测试以确认色谱柱的性能。
C.初始柱效测定
1. 使用色谱柱之前，需要先进行一次柱效测试。沃特世建议您在收到色谱柱后使用“性能测试色谱图"中所述的溶质混合物对色谱柱进行测试。但是，如果色谱柱只用于单次常规等度分析，那么在等度条件下测试色谱柱可能更方便。请记录初始色谱柱性能。
2. 测定理论塔板数(N)，并定期对比该数值。
3. 按预定的时间间隔进行重复测试，跟踪色谱柱性能随时间的变化情况。采用两套不同的HPLC系统进行测试时，所得柱效结果可能会有微小差异，这可能是由于连接质量、运行环境、系统电子设备、试剂质量、色谱柱条件和操作员技术等因素所致。
